ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВВЕДЕНИЕ

 В настоящее время во всем мире растет интерес к получению природных биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами (²Н, ¹³С, ¹⁵N, ¹⁸О и др), которые необходимы для многочисленных биохимических и диагностических целей [1], структурно-функциональных исследований [2], а также для изучения клеточного метаболизма [3]. Тенденции к предпочтительному использованию стабильных изотопов по сравнению с радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле спектроскопией ¹Н ЯМР [4, 5], ИК- и лазерной спектроскопией [6], а также масс-спектрометрией [7]. Развитие технической и компъютерной оснащенности аналитических методов позволило существенно повысить эффективность проведения биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия БАС на молекулярном уровне [8]. Большое научно-прикладное значение в этом аспекте имеют соединения нуклеиновой природы, содержащие дейтериевую метку в углеродном скелете молекулы [9]. В частности, ²Н-меченые рибонуклеозиды в ближайшем будущем смогут найти применение в матричных синтезах молекул дейтерированных РНК для изучения их пространственной структуры и конформационных изменений [10].

Важным моментом в исследованиях с применением изотопно меченых БАС является их доступность. Дейтериймеченые БАС могут быть синтезированы с использованием химических, ферментативных и биосинтетических методов [11, 12]. Однако химические синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят к конечному продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-форм, для разделения которых требуются специальные методы [13]. Более тонкие синтезы меченых БАС связаны с комбинацией химических [14] и ферментативных подходов [15, 16]. Стратегия синтеза изотопно-меченых БАС более подробно освещена в работе ЛеМастера [17]. 

         Для многих научно-практических целей биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу биосинтетический метод получения дейтериймеченых БАС, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению дейтерия в молекулы и к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений [18]. Традиционным подходом при этом остается предложенный Креспи метод выращивания штаммов-продуцентов в средах с максимальными концентрациями дейтерия [19]. Однако основным препятствием является недостаток ²Н-меченых ростовых субстратов с высоким уровнем дейтерированности. Прежде всего это связано с ограниченной доступностью и дороговизной самого высокоочищенного дейтерия, выделяемого из природных источников. Природная распространенность дейтерия составляет лишь 0.015% (относительно общего количества элемента), однако несмотря на невысокое содержание дейтерия в пробах разработанные в последние годы методы обогащения и очистки позволяют получать ²Н-меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты [20].

         Начиная с первых экспериментов Даболла и Кокса по выращиванию природных объектов в тяжелой воде, разрабатываются подходы с использованием гидролизатов ²Н-меченой биомассы как ростовых субстратов для синтеза штаммов-продуцентов БАС [21, 22]. Однако эксперименты обнаружили бактериостатический эффект ²Н₂О, заключающийся в ингибировании жизненно-важных функций клетки, оказываемой 40% ²Н₂О на растительные клетки [23] и 80-90% ²Н₂О на клетки простейших и бактерий [24]. Попытки использовать для синтеза в ²Н₂О природных объектов различной таксономической принадлежности, включая бактерии, микроводоросли [25] и дрожжи [26] предпринимались в течение длительного времени. Однако широкого распространения в биотехнологии они не получили ввиду трудности синтеза, использования сложных комплексных ростовых сред, сложности технологической схемы синтеза и т. п. Поэтому целый ряд практических вопросов биосинтеза ²Н-меченых БАС в ²Н₂О остается не выясненным.

Более перспективны схемы синтеза с использованием в качестве ²Н-меченых ростовых субстратов биомассы метилотрофных бактерий, ассимилирующих метанол по рибулозо-5-монофосфатному (РМФ) и сериновому пути фиксации углерода, интерес к которым возрастает благодаря интенсивному развитию технологии химического синтеза метанола [27, 28]. Уровень ассимиляции биомассы метилотрофов клетками простейших организмов и эукариот составляет 85-98%, а их производительность, измеренная по уровню биоконверсии метанола в клеточные компоненты, достигает 50% [29]. Как было показано нами раннее, метилотрофные бактерии очень неприхотливые объекты, растут на минимальных средах с 2-4% метанолом, в которых другие контаминантные бактерии не размножаются и достаточно легко адаптируются к максимальным концентрациям ²Н₂О, что существенно для синтеза ²Н-меченых БАС [30, 31]. Большой научно-практический интерес к использованию дейтерированной метилотрофной биомассы для синтеза продуцентов рибонуклеозидов определил цель настоящей работы, связанной с изучением принципиальной возможности биосинтеза ²Н-меченого инозина штаммом Bacillus subtilis за счет использования гидролизата факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum.

Таблица 1. Изотопный состав ростовых сред и биосинтетические характеристики B. methylicum

Номер опыта	Компоненты среды, об.%            H2O         2H2O Метанол  [U-2H]                                                     Метанол				Лаг-период, ч	Выход микробной биомассы, % от контроля	Время генерации, ч
1	98	0	2	0	20	100	2.2
2	98	0	0	2	30	92.3	2.4
3	73.5	24.5	2	0	32	90.6	2.4
4	73.5	24.5	0	2	34	85.9	2.6
5	49.0	49.0	2	0	40	70.1	3.0
6	49.0	49.0	0	2	44	60.5	3.2
7	24.5	73.5	2	0	45	56.4	3.5
8	24.5	73.5	0	2	49	47.2	3.8
9	0	98.0	2	0	58	32.9	4.4
10	0	98.0	0	2	60	30.1	4.9
10’	0	98.0	0	2	40	87.0	2.8

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для синтеза ²Н-меченого инозина использовали мутантный штамм грамположительных бактерий Bacillus subtilis (предварительно адаптированный к дейтерию скринингом до отдельных колоний), который из-за нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых рибонуклеозидов синтезирует в стандартных условиях выращивания (дрожжевая среда, поздний экспоненциальный рост, 32-34⁰С) 17 г инозина на 1 л культуральной жидкости (КЖ) [32]. Максимальный выход инозина достигался при использовании природной протонированной среды, содержащей в качестве в качестве источников ростовых факторов и аминного азота 2% БВК дрожжей, а в качестве источника углерода и энергии глюкозу (не менее 12 мас.%). При проведении синтеза требовалось заменить протонированные ростовые субстраты их дейтерированными аналогами, а также использовать ²Н₂О высокого уровня изотопной чистоты. Для решения поставленной задачи использовали адаптированный к дейтерию штамм факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum с 50% уровнем биоконверсии метанола (при эффективности конверсии 15.5-17.3 г сух. биомассы на 1 г потребленного субстрата) [33]. Проведение адаптации для B. methylicum определялось необходимостью улучшить ростовые характеристики штамма в максимально дейтерированной среде, поэтому использовали ступенчато-увеличивающийся градиент концентрации ²Н₂О в ростовых средах в присутствии 2% метанола (табл. 1). Для изучения влияния уровня дейтерированности источника углерода на ростовые параметры штамма в опытах (1, 3, 5, 7 и 9) использовали протонированный метанол, а в опытах (2, 4, 6, 8 и 10) [U-²Н]метанол. Согласно полученным данным замена протонированного метанола его дейтерированным аналогом в условиях одинаковой концентрации ²Н₂О в среде приводила к небольшим уменьшениям ростовых характеристик штамма (табл. 1, опыты 2, 4, 6, 8 и 10). Поэтому в дальнейших опытах использовали среды с ²Н₂О и [U-²Н]метанолом. На контрольной протонированной среде (1) с водой и метанолом продолжительность лаг-периода и времени клеточной генерации B. methylicum составили 20 и 2.2 ч, а выход микробной биомассы 200 г с 1 л КЖ (табл. 1, опыт 1). В промежуточных опытах (2-10) биосинтетические параметры изменялись пропорционально концентрации ²Н₂О. Найденная закономерность заключалась в увеличении продолжительности лаг-периода и времени клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы с фиксированием самых низких значений этих параметров в максимально дейтерированной среде с 98% ²Н₂О и 2% [U-²H]метанолом (табл. 1, опыт 10). За ходом адаптации, условия которой показаны в опыте 10’ (табл. 1) наблюдали, снимая динамики роста исходного (б) и адаптированного к дейтерию (в) штамма в максимально дейтерированной среде М9 (рис. 1, контроль (а) получен в протонированной среде), а также по изменению продолжительности лаг-периода, времени генерации и выходов микробной биомассы (рис. 2). В отличие от адаптированного штамма (в), ростовые динамики исходного штамма (б) в максимальной дейтерированной среде ингибировались дейтерием (рис. 1).

Выход микробной биомассы у адаптированного штамма (в) уменьшался на 13% по сравнению с контрольными условиями (рис. 2, а) при увеличении времени генерации до 2.8, а продолжительности лаг-периода до 40 ч (рис. 2, в). Адаптированный штамм возвращался к нормальному росту при переносе в протонированную среду после пролонгированного лаг-периода, что доказывает фенотипическую природу феномена адаптации, хотя теоретически не исключается, что эффект реверсии стабильно сохраняется при росте в ²Н₂О, но маскируется при переносе клеток в протонированную среду. Улучшенные ростовые характеристики адаптированного метилотрофа существено упрощают схему синтеза ²Н-меченой биомассы, оптимальным условиям которой удовлетворяет максимально дейтерированная среда М9 с 98% ²Н₂О и 2% [U-²Н]метанолом с инкубационным периодом 5-6 сут при 37⁰С.  

Схема синтеза ²Н-меченого инозина разрабатывалась с учетом способности метилотрофных бактерий синтезировать большое количество белка (выход 50% от веса сухого вещества), 15-17% полисахаридов, 10-12% липидов (в основном, фосфолипиды) и 18% зольных веществ [34]. Гидролиз биомассы проводили автоклавированием в 0.5 н. ²НCl (в ²Н₂O), чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции обратного (¹Н-²Н) обмена в аминокислотных остатках молекул белков. Качественный и количественный состав ароматических аминокислот метилотрофного гидролизата изучали в дейтерированной среде М9 на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) с сульфированной смолой UR-30, а уровни дейтерированности молекул масс-спектрометрией электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот. Гидролизат представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при 440 нм) при выходах аминокислот, сопоставимом с потребностями штамма в источниках углерода и аминного азота (табл. 2). При этом индикатором, определяющим высокую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит высокий уровень дейтерированности молекул аминокислот, который варьирует от 49% для лейцина/изолейцина до 97.5% для аланина (табл. 2).

Биосинтетические характеристики штамма B. subtilis снимали в протонированной дрожжевой среде с обычной водой и синтетической тяжеловодородной среде с ²Н₂О и 2% ²Н-меченым метилотрофным гидролизатом B. methylicum (рис. 3). Отмечена корреляция в характере изменения ростовых динамик (рис. 3, 1а, 2а), выхода инозина (рис. 3, 1б, 2б) и ассимиляции глюкозы (рис. 3, 1в, 2в). Максимальный выход инозина (17 г/л) зафиксирован в опыте 1б (рис. 3, 1б) на протонированной среде при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 3, 1в). На тяжеловодородной среде выход инозина снижался в 4.4 (3.9 г/л) (рис. 3, 2б), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л неассимилируемой глюкозы в КЖ (рис. 3, 2в).

Таблица 2. Аминокислотный состав метилотрофного гидролизата и уровни дейтерированности молекул

Полученный результат требовал изучение содержания глюкозы в биомассе штамма после гидролиза, осуществленное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 3). Смесь гидролизных сахаров в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки) составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды (мальтоза, сахароза), а также четыре других неидентифицированных сахара с временами удерживания 3.08 (15.63%), 4.26 (7.46%), 7.23 (11.72%) и 9.14 (7.95%) мин (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21.4% от сух. веса, то есть выше, чем фруктозы (6.82%), рамнозы (3.47%), арабинозы (3.69%) и мальтозы (11.62%). Их выхода существенно не отличались от контроля на Н₂О, за исключением сахарозы, не детектируемой в дейтерированном гидролизате.

Таблица 3. Состав сахаров гидролизата штамма-продуцента

Применение сложных физико-химических методов для выделения биосинтетически ²Н-меченого инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высокой степени хроматографической чистоты. Поскольку в КЖ наряду с синтезируемым продуктом присутствуют примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, а также сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводили ступенчатое фракционирование КЖ. Повышенная чувствительность инозина к кислотам и щелочам и его нестабильность при выделении диктовали использование кислотных и щелочных растворов низкой концентрации, а также по-возможности проводить выделение при низких температурах, избегая длительного перегрева реакционной смеси. Фракционирование КЖ заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом, твердофазной адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстрактивного извлечения продукта, перекристаллизации и ионообменной хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемператрным осаждением ацетоном при -4⁰С, проводя последующую адсорбцию суммы рибонуклеозидов активированным углем на холоду. Десорбированные рибонуклеозиды извлекали из прореагировавшей твердой фазы элюцией этанольно-аммиачным раствором при 60⁰С, а сам инозин экстракцией 0.3 М NH₄-формиатным буфером (рН 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле. Окончательная стадия очистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0.3 М NH₄-формиатным буфером с 0.045 М NH₄Cl с ТСХ контролем при R_f 0.5. Данные по выделению инозина из КЖ штамма-продуцента представлены в виде спектров УФ-поглощения на рис. 4, а-в. Наличие в синтетическом образце (в) основной полосы поглощения I, соответствующей нативному инозину (l_max 249 нм, e₂₄₉ 7100 М^-1 см^-1) и отсутствие вторичных метаболитов II и III неоспоримо доказывает его однородность и тем самым эффективность разработанного метода выделения со степенью хроматографической чистоты 92%.

 Уровень дейтерированности инозина исследовали методом масс-спектрометрии FAB из за высокой чувствительности, позволяющей детектировать 10^-8-10^-10 моль вещества в пробе, что существенно выше чем при использовании ¹Н ЯМР-спектроскопии [7]. Пути фрагментации молекулы методом FAB приводят к распаду инозина на фрагмент рибозы А с Мr при массовом соотношении m/z 133 и гипоксантиновый фрагмент Б c Мr m/z 136 (их распад сопровождался миграцией протона Н⁺), который в свою очередь расщепляется на ряд менее низкомолекулярных осколочных фрагментов В, Г, Д, Е и Ж при m/z 109, 108, 82, 81 и 54 за счет элиминирования НСN и СО из гипоксантина (схема).

Биосинтетический ²Н-меченый инозин (масс-спектр приведен на рис. 5, б относительно контроля (а)), представлен смесью изотопнозамещенных форм молекул с различным количеством атомов водорода, замещенных на дейтерий. Подсчет уровня дейтерированности молекулы инозина определяли, сравнивая величины пиков молекулярных ионов Мr инозина дейтерированного и протонированного образцов (формирование пика молекулярного иона инозина сопровождалось миграцией протона Н⁺). Пик (М+Н)⁺ полиморфно расщеплялся на отдельные кластеры с примесью молекул со статистическим набором массовых чисел m/z с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности с включением четырех (m/z 273, 20%), пяти (m/z 274, 38%), шести (m/z 275, 28%) и семи атомов дейтерия (m/z 276, 14%) (табл. 4).

Суммарный уровень дейтерированности молекулы (УД), вычесленный по приводимой ниже формуле составил 61% от общего количества атомов водорода в углеродном скелете молекулы. 

             M_r1 C₁ + M_r2 C₂ + ....... + M_rn C_n

УД = ______________________________   

                                  S C_n     

(M_r - величины пиков молекулярных ионов инозина; С_n - вклад в уровень дейтерированности, мол.%).

Анализ масс-спектра FAB выявил включение атомов дейтерия в рибозный и гипоксантиновый фрагменты молекулы, что подтверждено присутствием двух “тяжелых” пиков фрагментов рибозы А m/z 136, 46% (вместо m/z 133, 41%) и гипоксантина Б m/z 138, 55% (вместо m/z 136, 48%), а также пиков низкомолекулярных фрагментов, продуктов распада гипоксантина В m/z 111, 49% (вместо m/z 109, 45%) и Г m/z 84, 43% (вместо m/z 82, 41%) (рис. 5).

Таблица 4. Величины пиков (М+Н)⁺ в масс-спектрах FAB и уровни дейтерированности инозина

Эффект множественного мечения определяется способом получения дейтерированных молекул и свидетельствует о недостаточно высокой селективности биосинтетической схемы, повысить которую возможно контролем изотопного состава синтетической ростовой среды и исключения источников дополнительных протонов.